植物组织培养灭菌及无菌操作技术


植物(plant)组织培养灭菌及无菌操作控制技术(technology)

 
[目的要求] 认识各类灭菌(Sterilization)剂,掌握其性质、使用(use)方法;通过(tōng guò)在超净工作台上进行无菌操作训练,使学生初步掌握组织培养的无菌操作技术,养成无菌操作习惯。 [知识模块] 灭菌技术、无菌操作技术 [重点] 植物组织培养各类设备及人员消毒的方法 [难点] 无菌操作规程 [方法] 采用一体化教学方法,教师借用多媒体进行简要的讲授后学生分组操作实践。  
  一、植物组织培养灭菌 1.湿热灭菌(培养基):在制备后的24h内完成灭菌工序。 ⑴对高压灭菌后不变质的物品,可以延长灭菌时间或提高压力。 ⑵对于一些布制品,洗净晾干后用耐高压塑料袋装好,高压灭菌20-30min。 ⑶高压灭菌前后的培养基,其pH值下降0.2-0.3单位,要控制好灭菌的温度和时间。 ⑷高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖,从而改变培养基的渗透压。 ⑸培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解,高压下蔗糖水解大大增强,添加1%活性炭,蔗糖水解率可达5%。 注意事项:防止高压灭菌培养基变化的方法
  (1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料,及时采取有效措施。压力蒸汽灭菌器具有造型新颖美观、结构合理、功能齐全、加热迅速、灭菌彻底等优点。适用于医疗、科研、食品、等单位对手术器械、敷料、玻璃器皿、橡胶制品、食品、药液、培养基等物品进行灭菌。
  (2)设计(design)培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂(Reagent)并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇,以IBA代替IAA,控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。
  (3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入(jiā rù)的顺序。如将磷(P)、钙和铁放在**后加入。
  (4)注意高压灭菌(Sterilization)后培养基pH值的变化及回复动态。压力蒸汽灭菌器具有造型新颖美观、结构合理、功能齐全、加热迅速、灭菌彻底等优点。适用于医疗、科研、食品、等单位对手术器械、敷料、玻璃器皿、橡胶制品、食品、药液、培养基等物品进行灭菌。如高压灭菌后的pH值常由5.80升高**6.48。而96h后又回降**5.8左右。这样在实验(experiment)中就可以根据这一规律加以掌握。 2.过滤灭菌(不耐热的物质 )如一些抗生素类物 3.紫外线和熏蒸灭菌(空间)
  (1)紫外线灭菌:在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线的波长为200—300nm,其中以260nm的杀菌能力**强,但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱,所以只适于空气和物体表面的灭菌,而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。在接种前打开紫外灯进行房间(room)及超净台灭菌30min,然后进行接种。
  (2)熏蒸灭菌:用加热焚烧、氧化等方法(method),使化学(huà xué)药剂变为气体状态扩散到空气中,以杀死空气和物体表面(appearance)的微生物。这种方法简便,只需要把消毒的空间关闭紧密即可。 常用熏蒸剂是甲醛,熏蒸时,房间关闭紧密,按5—8ml/m3用量,将甲醛置于广口容器中,加5g/m3高锰(manganese)酸钾氧化挥发。熏蒸时,房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸,但效果不如甲醛。 4.喷雾灭菌(物体表面) 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等,可用70%的酒精反复涂擦灭菌,l%-2%的来苏儿溶液以及0.25%—1%的新洁尔灭也可以。 5.植物材料表面用消毒剂灭菌(外植体) 从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带人培养基,便会造成培养基污染。因此,植物材料必须(have to)经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手续接到培养基上,这一过程叫做接种。 **步,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净,置自来水龙头下流水冲洗几分钟**数小时,冲洗时间视材料清洁(clean)程度而宜。 洗时可加入洗衣粉清洗,然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物,除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触(contact)。当然,**理想的清洗物质是表面活性物质—吐温。 第二步对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10~30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用,加之70%酒精穿透力强,也很易杀伤植物细胞,所以浸润时间不能过长。 第三步用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取1—2种使用(use)见表。 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表
灭菌剂 使用浓度(%) 持续时间(min) 去除的难易 效果 次氯酸钙 9~10 5~30 易 很好 次氯酸钠 2 5~30 易 很好 氯化汞 0.1~1 5~8 较难 **好 抗菌(anti-microbial)素 4~50mg/L 30~60 中 较好
上述灭菌(Sterilization)剂应在使用前临时配制,灭菌后用无菌水涮洗3—4次即可;用升汞液灭菌的材料,难以对升汞残毒较难筛除,所以应当用无菌水涮洗8~10次,每次不少于3min,以尽量去除残毒。 灭菌时,把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中,记好时间,倒人消毒溶液,不时用玻璃棒轻轻搅动,以促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱除气泡,使消毒彻底。灭菌时间是从倒人消毒液开始,**倒入无菌水时为止。吐温的用量和灭菌时间,一般加入灭菌液的O.5%,即在100ml加入15滴。 **后一步是用无菌水涮洗,涮洗要每次3min左右,视采用的消毒液种类,涮洗3-l0次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。  
  二、无菌操作技术
  一、用品 超净工作台、75%的酒精、95%的酒精、盛有培养基的培养瓶、接种器械(主要指解剖刀、剪刀、镊子等)、酒精灯、培养材料(根、茎、叶或种子等)、0.1%的升汞(或漂白粉)、无菌(fungus)水等。生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时,用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料,使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。
  二、方法步骤 (一)在接种前4h用甲醛与高锰酸钾混合薰蒸接种室,并打开紫外灯照射30min; (二)正式接种前半小时左右,打开超净工作台上的紫外灯和风机,20~30min后接种;
  (三)用肥皂水洗净双手,在缓冲间内穿好灭过菌的实验(experiment)服、帽子与拖鞋,进入接种室; (四)用75%的酒精擦拭工作(gōng zuò)台面和双手; (五)用蘸(zhàn)有75%酒精的纱布擦拭装有培养基的培养器皿,放进工作台;    
  (六)把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%酒精中,在火焰上灭菌后,放在器械架上;    
  (七)把植物材料放进75%的酒精中浸泡约30s,再在0.1%的升汞中浸泡5~10min,或在10%的漂白粉(化学式Ca(ClO)?)上溶液中浸泡10~15min,浸泡时可进行搅动,使植物材料与灭菌剂有良好的接触;然后用无菌水冲洗3~5次;    
  (八)用火焰烧瓶口,转动瓶口使瓶口各部分都烧到,打开封口塑料;    
  (九)取下接种器械,在火焰上灭菌;    
  (十)把培养材料(Material)迅速放入培养瓶,扎上瓶口(每人接种5~10瓶)。操作期间应经常用75%酒精擦拭工作台和双手;接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上灭菌;    
  (十一)接种结束后,清理和关闭超净工作台。

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