植物组织培养室及培养用具的消毒与灭菌


  一、目的要求
1、通过(tōng guò)实验,培养学生良好的卫生观念,确立组织培养的无菌意识。
2、掌握组织培养室的消毒及灭菌方法。
3、掌握培养用具的干热灭菌(Sterilization)(fungus)的一般操作技术。

  二、仪器与用具
1、用具:喷雾器、工作(gōng zuò)服、口罩、手套(gloves)等。
2、药品:2%新洁尔灭,高锰酸钾,甲醛,70%酒精。

  三、方法步骤
(一)植物组织培养室的灭菌
1、地面(ground)、墙壁和工作台的灭菌:用2%新洁尔灭喷雾。
(1)配方:取新洁尔灭原液20ml,加水980ml,配成2%新洁尔灭溶液。
(2)方法:将配好的2%新洁尔灭溶液倒入喷雾器内,进行均匀(jūn yún)喷雾。压力蒸汽灭菌器是应用**早、效果**可靠、使用**广泛的一种物理灭菌方法。
(3)注意的地方:

  ①墙壁、角落、地面喷雾要均匀,不要遗漏;

  ②注意安全,在喷房顶时,要特别小心,防止药液雾滴掉入眼睛。
2、无菌(意思:没有活菌)室和培养室的灭菌(Sterilization):用甲醛和高锰酸钾熏蒸,1年中熏蒸1-2次。
(1)配方:每立方米空间用甲醛10ml加高锰酸钾5g的配比液熏蒸。
(2)方法:首先房子要密封(seal)。然后在房子中间放一口缸或大烧杯,将称好的高锰酸钾放入缸内,再把已称量的甲醛溶液慢慢倒入缸内,完毕,人迅速离开,并关上门,密封3天。
(3)注意事项:

  ①操作前要戴好口罩及手套;

  ②倒入甲醛(Formaldehyde)时要小心,因为甲醛遇到高锰酸钾会迅速沸腾,并产生大量烟雾。操作时人要迅速避开烟雾;

  ③3天后,打开房间,搬走费液缸;一周后,方可进入操作控制。
3、在已经熏蒸过的房间(room)内,用70%酒精纱布擦洗培养架、工作台。
4、用紫外灯照射20—30min。
5、使用前,再用70%酒精喷雾,使空间灰尘落下。
(二)培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌(湿热灭菌法)
(1)洗涤:把组织培养基用的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗。自然晾干或烘箱干燥。
(2)包扎:用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿(ware)和金属器械分别包扎好。
(3)装水:在高压灭菌(fungus)锅内装入一定量的水(水要淹没电热丝(类别:铁铬铝合金丝、镍铬合金丝))。(切忌干烧!)
(4)装物品:在灭菌锅内放入含培养基的培养瓶或三角瓶、装蒸馏水的玻璃瓶,以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。压力蒸汽灭菌器是应用**早、效果**可靠、使用**广泛的一种物理灭菌方法。
(5)灭菌:将排气(Exhaust)阀开着,加热,直**锅内释放(release)出大量水蒸气(此时水蒸气横向喷出),再关闭阀们;或者当锅内压力升**49.0KPa时,开启排气阀,将锅内的冷空气全部排出。当锅内压力达到108KPa时,温度为121℃时,维持15-20分钟,即可达到灭菌的目的。(若灭菌时间过长,会使培养基中的某些成分变性失效。)切断(割开;截断)电源,让灭菌锅自然冷却(cooling)。
注意:
  ①先打开放气阀,再打开锅盖。(以免锅内压力大而爆炸(blow up)!)

  ②开盖后应尽快转移培养瓶,使培养瓶冷却、凝固(solidification)。一般应将灭菌后的培养瓶储藏于30℃以下的室内,**好储藏在4-10℃的条件下。

  ③某些生长(Grow)调节剂如IA
  A、Z
  
  T、ABA等以及某些维生素遇热是不稳定(解释:稳固安定;没有变动)的,不能同培养基一起高压灭菌(Sterilization),而需要进行过滤灭菌。
2、培养用具的灭菌(fungus)——干热灭菌法
(1)玻璃器皿的灭菌:湿热灭菌法或干热灭菌法。
(2)金属器械的灭菌:干热灭菌或火焰灭菌法。
(3)布质制品的灭菌:均用湿热灭菌法。(注意:布质制品绝不能干热灭菌!)
干热灭菌方法(method):
(1)洗涤:把组织培养用的培养皿、三角瓶、试管、移液管等玻璃器皿(ware)进行彻底清洗(Cleaning)。压力蒸汽灭菌器具有造型新颖美观、结构合理、功能齐全、加热迅速、灭菌彻底等优点。适用于医疗、科研、食品、等单位对手术器械、敷料、玻璃器皿、橡胶制品、食品、药液、培养基等物品进行灭菌。(2)包扎:玻璃器皿可放在大的玻璃容器中,金属器械可放在金属盒内。
(3)灭菌:器皿在烘箱中,150℃,干热灭菌1小时;或120℃,2小时。灭菌完毕,待冷却后取出。