一,灭菌的方法
灭菌指利用物理和化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程.
消毒是指用物理或化学的方法杀死物料,容器,器具内外的病源微生物,一般只能杀死营养细胞而不能杀死芽孢.
消毒不一定能达到灭菌的要求,而灭菌则可达到消毒的目的.
⒈ 干热灭菌法
进行干热灭菌（fungus)时,微生物细胞发生氧化,微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用,其中氧化作用导致微生物死亡是主要依据.由于微生物对干热的耐受力比对湿热强得多,故干热灭菌所需的温度要高,时间要长,一般160～170 ℃,1～1.5 h.
实际应用时,对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法.
⒉ 火焰灭菌法
利用火焰直接杀死微生物的灭菌法称为火焰灭菌法.该法方法简单,灭菌彻底,但使用范围有限,仅适用于接种针,玻璃棒,三角瓶口等的灭菌.
⒊ 电磁波,射线灭菌法
以紫外线**常用.紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用,但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强.紫外线的穿透力低,仅适用于表面灭菌和无菌室,培养间等空间的灭菌,且距照射物不超过1.2 m;对固体物料灭菌不彻底,也不能用于液体物料的灭菌.
⒋ 湿热灭菌法
利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌法.其原理是借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞(cell)中的蛋白质,酶和核酸分子内部的化学键,特别是氢键受到破坏,引起不可逆的变性,使微生物死亡.由于蒸汽有很强的穿透能力,湿热灭菌对耐热芽孢杆菌来说,温度升高10 ℃时,灭菌速度常数可增加8～10倍,对营养细胞更高.蒸汽来源方便,价格低廉,灭菌效果可靠,是目前**为常用的灭菌方法.一般的湿热灭菌条件(tiáo jiàn)为121 ℃,30 min.
⒌ 化学药剂灭菌(Sterilization)法
某些化学药剂能与微生物发生反应而具有杀菌的作用.
化学药剂适于生产车间环境的灭菌,接种操作控制前小型器具的灭菌等.
化学药品的灭菌使用方法,根据灭菌对象的不同有浸泡,添加,擦拭,喷洒,气态熏蒸等.
⑴ 高锰酸钾 高锰酸钾溶液的灭菌作用是使蛋白(protein)质,氨基酸氧化,使微生物死亡,一般用0.1%～0.25%的溶液.
⑵ 漂白粉 漂白粉的化学名称是次氯酸盐(次氯酸钠,NaOCl),它是强氧化剂,也是廉价易得的灭菌剂.它的杀菌作用是次氯酸钠分解为次亚氯酸,后者不稳定,在水溶液中分解为新生态氧和氯,使细菌受强烈氧化作用而导致死亡,对杀死细菌和噬菌体均有效.
⑶ 75%酒精溶液 75%酒精溶液的杀菌作用在于使细胞脱水,引起蛋白质凝固变性.对营养细胞,病毒,霉菌孢子均有杀死作用,但对细菌的芽孢杀死作用较差.常用于皮肤和器具表面杀菌.
⑷ 新洁尔灭 新洁尔灭是表面活性剂类洁净消毒剂.它在水溶液中以阳离子形式与菌体表面结合,引起菌体外膜损伤和蛋白变性.10 min能杀死营养细胞,但对细菌芽孢几乎没有杀灭作用.一般用于器具和生产环境的消毒,不能与合成洗涤剂合用,不能接触铝制品.
⑸ 甲醛 甲醛(HCHO)是强还原剂,它能与蛋白质的氨基结合,使蛋白质变性,对氨基和蛋白质的变性有较强活性,这是用甲醛作为灭菌剂的根据.使用时可以以2份37%甲醛溶液与1份KMnO4混合,或者将37%甲醛溶液直接加热,产生气态甲醛用于灭菌.甲醛灭菌的缺点是穿透力差.
⑹ 过氧乙酸 过氧乙酸是强氧化剂,它是广谱,高效,速效的化学杀菌剂(成分：无机化合物),对营养细胞,细菌芽孢,真菌孢子和病毒都有杀灭作用.
⑺ 戊二醛 在酸性条件(tiáo jiàn)下,不具有杀死芽孢的能力,只有在碱性条件下,才具有杀死芽孢的能力,常用2%的溶液,常用于器具,仪器和工具等灭菌.
⑻ 酚类 苯酚毒性较大,易污染环境,且水溶性差,使应用受到限制,而酚类衍生物的使用,扩大了作为消毒剂的使用范围.
⒍ 过滤除菌法
利用过滤方法阻留微生物,也可达到除菌的目的,这就是过滤除菌法.
此法仅适用于澄清液体和气体的除菌.工业上常用过滤法大量制备无菌空气,供好氧微生物培养过程使用.
二,湿热灭菌的原理
三,培养基的灭菌
⒈ 培养基湿热灭菌方法(method)
⑴ 连续灭菌 连续灭菌也叫连消,其温度一般以126～132 ℃为宜,总蒸汽压力要求达到0.044～0.049 MPa以上.培养基采用连续灭菌时,需在培养基进入发酵罐前,直接用蒸汽进行空罐灭菌(空消),用无菌空气保压,待培养基流入罐后,开始冷却.灭菌时对培养基的加热可采用各种加热器.培养基的冷却方式方法有喷淋冷却式,真空冷却式,薄板换热器式几种方式,其过程均包括加热,维持和冷却.
连续灭菌流程
培养基配料 配料罐 加热器 维持罐 冷却器 无菌培养基
⑵ 间歇灭菌
间歇灭菌即实消,是在每批培养基全部流入发酵罐后,就在罐内通入蒸汽加热**灭菌温度,维持一定时间,再冷却到接种温度.实罐灭菌时,发酵罐与培养基一起灭菌.
其他灭菌设备一般采用蒸汽灭菌,如设备十分耐压,则可采用较高的温度,但必须注意设备内部的凹处及露出的小配管等蒸汽不能到达的部位.
⑶ 固体培养基灭菌
⒉ 影响培养基灭菌的因素
⑴ 培养基成分
油脂,糖类
低质量(quality)分数(1%～2%)的NaCl溶液
⑵ pH值
pH值6.0～8.0,微生物**耐热;pH<6.0,氢离子易渗入微生物细胞内,从而改变细胞的生理反应促使其死亡
⑶ 培养基中的颗粒
⑷ 泡沫 泡沫中的空气形成隔热层,使传热困难,热难穿透过去杀灭微生物
⒊ 分批灭菌(Sterilization)和连续灭菌比较
连续灭菌与分批灭菌比较的优点:
① 可采用高温短时灭菌,培养基受热时间短,营养成分破坏少,有利于提高发酵产率;
② 发酵又称酦酵罐利用率高;
③ 蒸汽负荷均衡;
④ 采用板式换热器时,可节约大量能量(energy);
⑤ 适宜采用自动控制,劳动强度小.
四,培养基与设备,管道灭菌条件
⑴ 杀菌(sterilization)锅内灭菌
⑵ 种子罐,发酵罐,计量罐,补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌
⑶ 空气总过滤器和分过滤器灭菌(Sterilization)
⑷ 种子培养基实罐灭菌
⑸ 发酵培养基实罐灭菌(Sterilization)
⑹ 发酵培养基连续灭菌
⑺ 消泡剂灭菌
⑻ 补料实罐灭菌
⑼ 尿素溶液灭菌(Sterilization)
第二节 空气的净化
一,空气净化的方法
对空气灭菌的要求一般可按10-3的染菌概率,即在1000次培养过程中,只允许一次是由于空气灭菌不彻底而造成染菌,致使培养过程失败.
⒈ 热灭菌法
空气在进入培养系统之前,一般均需用压缩机压缩,提高压力,空气经压缩后温度能够升到200 ℃以上,保持一定时间后,便可实现干热杀菌.
⒉ 静电除菌（fungus)
静电除菌是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的.
静电除尘
灭菌器示意
1—升压变压器;
2—整流器;
3—沉淀电极;
4—电晕电极
⒊ 介质过滤除菌法
过滤除菌法是让含菌空气通过过滤介质,以阻截空气中所含微生物,而取得无菌空气的方法.
通过过滤除菌处理(chǔ lǐ)的空气可达到无菌,并有足够的压力和适宜的温度以供好氧培养过程之用.
该法是目前广泛应用来获得大量无菌(意思：没有活菌)空气的常规方法.在空气的除菌方法中,介质过滤除菌生产中使用**多.
二,空气的过滤除菌原理和介质
⒈ 空气过滤除菌原理
当气流通过滤层时,基于滤层纤维的层层阻碍,迫使空气在流动过程中出现无数次改变气速大小和方向的绕流运动(movement),从而导致微生物微粒与滤层纤维间产生撞击,拦截,布朗扩散,重力及静电引力等作用,从而把微生物微粒截留,捕集在纤维表面上,实现了过滤的目的.
⑴ 布朗扩散截留作用
⑵ 拦截截留作用
⑶ 惯性撞击截留作用
⑷ 重力沉降作用
⑸ 静电吸引作用
各种机理各自所作贡献的大小:一般认为惯性撞击截留,拦截截留和布朗运动截留的作用较大,而重力和静电引力的作用则很小.
⒉ 空气(Basin air)过滤除菌（fungus)的介质
⑴ 纸类过滤介质
⑵ 纤维状或颗粒状过滤介质(起决定作用的物质)
① 棉花
② 玻璃纤维
③ 活性炭
⑶ 微孔滤膜类过滤介质
活性炭
微孔滤膜
⒊ 提高过滤(filter)除菌效率的措施
① 设计合理的空气预处理设备,选择(xuanze)合适的空气净化流程,以达到除油,水和杂质的目的.
② 设计和安装(installation)合理的空气过滤器,选用除菌效率高的过滤介质.
③ 保证进口空气清洁度,减少进口空气的含菌数.
④ 降低进入空气过滤器的空气相对湿度,保证过滤介质能在干燥状态下工作.
思 考 题
⒈ 灭菌的方法有哪些 如何根据灭菌对象和要求的不同选用不同的方法
⒉ 比较分批灭菌与连续灭菌的优不好的地方.
⒊ 分析过滤除菌机理与影响过滤除菌的因素,考虑如何提高(过滤除菌的效率.
